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慢病毒實驗技術實踐操作總結

時間:2016-01-03 16:20:04作者:admin文章來源:瀏覽:
慢病毒簡介慢病毒載體(Lentivirus Vector)是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發展起來的基因治療載體。能高效的將目的基因或RNAi片
慢病毒簡介
 
慢病毒載體(Lentivirus Vector)是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發展起來的基因治療載體。能高效的將目的基因或RNAi片段導入動物或者人的原代培養細胞或細胞系中,即將外源性基因有效的、穩定的整合到宿主染色體上,實現所謂“穩定整合”,從而使目的基因在目標細胞系中持久表達。其區別于一般的逆轉錄病毒載體的特點是對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。在這里,建議針對如神經元細胞、各種干細胞、心肌細胞等,通常印象中使用傳統的轉染手段如脂質體2000(Lipofectamine2000)、Qiagen Effecience transfection、或者電轉等難以實現目標基因或者RNAi片段有效整合的細胞,采用慢病毒載體感染的方法,問題將迎刃而解。

慢病毒技術
 
1、構建原理
 
慢病毒屬于逆轉錄病毒科 , HIV-1 DNA前病毒的主要結構基因及其排列形式5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。除 gag 、 po l 和 env 這 3 個和單純逆轉錄病毒相似的結構基因外 , 還包括 4 個輔助基因 :vif、vpr、nef、vpu 和 2 個調節基因 tat 和 rev ;
 
gag基因編碼病毒的核心蛋白,pol基因編碼病毒復制所需的酶類,env基因編碼病毒的包膜糖蛋白,pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。
 
2、構建原則
 
由于慢病毒技術是基于HIV系統;因此,降低并控制其實驗應用風險就是第一原則。主要使用的方法是將HIV原有的重要序列進行拆分和替換,減少其被拆分成分同源重組而產生具有復制增殖能力的病毒顆粒。
 
包裝成分:由 HIV 21 基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建 , 能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白 ;
 
載體成分:與包裝成分互補,含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV 21 順式作用序列。同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因;
 
水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質粒,分別取代表達HIV本身包膜蛋白Env的質粒,使HIV-1載體顆粒包上了VSV或雙嗜性MLV的包膜。這么做的意義:1、包膜的更換進一步降低了HIV-1載體恢復成野生型病毒的可能;2、使HIV載體感染宿主的范圍擴大到幾乎能感染所有組織來源的細胞;3、VSV的包膜賦予HIV載體顆粒高度的穩定性,使其能夠通過超速離心而濃縮,達到高滴度。
 
3、四質粒系統
 
目前,我們實驗室擁有的,能夠投入使用的慢病毒包裝體系有兩套,都是四質粒系統。分別為常用于構建shRNA體系的DR8.47、PDM2G、REV、PLVTH、pSUPER(pSUPER屬于過渡性質的,相當于二傳手角色,要的是它上面的啟動子,并不是包裝質粒),以及常用于過表達系統的PLP-1、PLP-2、VSVG、TOPO-dsRED/TOPO-Luciferase GFP。

 

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