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IHC實驗技術

時間:2016-01-03 19:51:12作者:admin文章來源:瀏覽:
免疫組織化學(Immunohistochemistry)又稱免疫細胞化學。它是組織化學的分支,它是用標記的特異性抗體(或抗原)對組織內抗原(或抗體)的分布進行組織和細胞原位檢測技術。
標本:組織標本:石蠟切片(病理切片和組織芯片)、冰凍切片;細胞標本:組織印片、細胞爬片、細胞涂片
操作步驟:
①石蠟切片制作
1、固定:取組織,用PBS沖洗,放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內固定12h
2、脫水:倒去固定液,用蒸餾水沖洗3次,再用50%酒精沖洗2次,用酒精逐級脫水,70%酒精1天,80%酒精過夜,95%酒精3h,無水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2h
3、透明:1:1無水酒精二甲苯45min,二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)各30min
4、包埋:(恒溫箱內進行)浸入石蠟,1:1二甲苯石蠟(58℃)45min,石蠟(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)共2.5h,用石蠟(Ⅲ)包埋組織
5、切片:包埋后的組織塊經修整后,用切片機切成5-7μm,的石蠟帶
6、貼片:將組織石蠟塊在50℃溫水中展片,然后用處理干凈的載玻片撈片,組織帶可黏在載玻片上
(洗片:1%HCl浸泡過夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂膠:防脫劑多聚賴氨酸)
7、烤片:68℃恒溫箱內烤片2h
②SP三步法
1、脫蠟:脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60min,或60℃恒溫箱中烘烤20min,后用二甲苯(Ⅰ)、(Ⅱ)浸泡,共25min
2、水化:無水酒精(Ⅰ)、(Ⅱ)各2min,下行至95%、80%、70%酒精(Ⅰ)(Ⅱ)各2min
3、PBS沖洗2-3次,每次5min
4、阻斷:3%H2O2去離子水(或80%甲醇)孵育10min,以滅活內源性過氧化物酶活性
5、PBS沖洗2-3次,每次5min
6、抗原修復:置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷卻20min以上,再用冷水沖洗缸子,加快冷卻至室溫
7、PBS沖洗2-3次,每次5min
8、封閉:滴加正常山羊血清封閉液,室溫孵育20min,甩去多余液體
9、滴加Ⅰ抗50μl,室溫靜置1h,或者37℃1h,或者4℃過夜(需在37℃復溫45min)
10、PBS沖洗2-3次,每次5min
11、滴加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置1h,或37℃1h
12、PBS沖洗2-3次,每次5min
13、滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶),室溫或37℃孵育30min-1h
14、PBS沖洗2-3次,每次5min
15、顯色:DAB顯色5-10min,在顯微鏡下掌握染色程度(胞漿呈棕色者判定為陽性細胞)
(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)
(A:DAB  B:H2O2 C:磷酸緩沖液)
16、自來水沖洗10分鐘終止反應
17、復染:蘇木精復染2min,鹽酸酒精分化
18、自來水沖洗10-15min
19、常規脫水、透明、封片(用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上)、鏡檢
③結果分析:每張切片選擇5個高倍鏡視野(400X),應用圖像分析系統進行定量灰度掃描后進行分析。
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