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WB常見問題分析

時間:2016-01-03 16:01:46作者:admin文章來源:瀏覽:
WB實驗常見問題分析:1 沒有信號標本問題標本中不含檢測蛋白:設置陽性對照上樣量不夠,或者蛋白表達豐度比較低:增加上樣量轉膜問題轉膜
WB實驗常見問題分析:

1. 沒有信號

標本問題 
標本中不含檢測蛋白:設置陽性對照
上樣量不夠,或者蛋白表達豐度比較低:增加上樣量
轉膜問題
轉膜不完全:轉膜后使用麗春紅染色,確定目的大小蛋白條帶是否存在于膜上,使用蛋白質Marker.
洗滌過度:減少洗滌時間和次數.
封閉
封閉過度:減少封閉試劑濃度,封閉時間,更換封閉試劑
抗體孵育和檢測
抗體濃度和時間孵育不夠:增加抗體濃度,延長孵育時間
一抗不工作:設置陽性對照
二抗不工作:和其他一抗配合檢測二抗是否工作
一抗/二抗不匹配:檢查抗體的來源和亞型。正確選擇二抗
底物失活:重新配制有效的底物

2.背景高

封閉
封閉時間不夠:延長封閉時間
優化封閉試劑的類型和濃度
封閉試劑和抗體有交叉反應:更換封閉試劑.
磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑:推薦BSA封閉
 
抗體孵育和檢測
一抗/二抗濃度太高:降低抗體濃度
孵育溫度太高:建議4度孵育過夜
 
其他
洗膜不充分:5*3mins,多次短時間的洗膜
曝光時間過長:縮短曝光時間
出現干膜現象:保證膜充分浸透,避免出現干膜
二抗非特異性:設置只加二抗對照

3.非特異性條帶

標本制備
二聚體或者多聚體:增加上樣前煮沸變性時間
蛋白不同剪切體或者 isoforms 存在.
蛋白降解:使用新鮮制備的標本,標本中加入新鮮配制的蛋白酶抑制劑
上樣量過大:減少上樣量
封閉Blocking
封閉不充分:優化封閉時間和封閉試劑濃度
抗體孵育和檢測
一抗/二抗濃度過高:降低抗體濃度
抗體沒有經過純化
二抗非特異性結合:使用二抗對照
其他
洗膜保證充分

4.條帶大小不對

標本制備
二聚體/多聚體存在:使用還原變性電泳,除非說明書上有特殊說明
多個亞型存在?(Isoforms)
蛋白降解?
蛋白修飾
 

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